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马传染性贫血琼扩抗原生产工艺的改进

2012-8-17 14:22:00  来源:  互联网  网友评论()

 
    马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)是逆转录病毒科慢病毒属的成员之一,其基因组结构与人免疫缺陷病毒Ⅰ型(Human innunodeficiency virus type 1,HIV-Ⅰ)相似。马传染性贫血呈世界性分布,常引起慢性感染,以发热、贫血为特征,耐过马呈隐性感染并终身带毒。20世纪70年代初期,Coggins博士建立了检测感染马血清抗体的琼脂扩散试验(AGID),成为检测EIA的标准方法。此外,用于马传贫的诊断方法还有补反试验(CF),补反抑制试验(CFI),病毒中和试验(VN),免疫荧光法(IF)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等。我国也相继建立了检测马传贫病毒抗体的AGID和ELISA诊断方法。AGID诊断方法因其操作简单方便,判定结果可靠,一直得到广泛应用,美国正是采用这种诊断方法控制了马传贫的流行。自1976年我国将AGID用于诊断马传贫以来,为控制马传贫起到了积极的推动作用。但按我国现行《规程》生产马传贫琼扩抗原,每100ml病毒培养液只能生产5ml抗原,本实验通过改变培养液和除醚的方法,即把现行《规程》中使用的0.5%的乳汉液改变为0.5%的乳汉液和MEM培养基各50%的混合培养液,除醚方法由自然挥发法改为机械正压鼓风法,使每100ml病毒培养液可生产20 ml抗原,大大提高了抗原生产率,节约了生产成本,现把改进方法报告如下。
 
1   材料与方法

1.1  种毒  马传贫病毒在驴胎皮肤细胞上继代的传代毒,最低感染量不低于108TCID50/ml。

1.2  细胞   驴胎皮肤细胞,由本室自制,使用代次为5~40代。

1.3  培养液  MEM培养基和水解乳蛋白购自Gibco公司,成牛血清由本室自制,琼脂购自BBI公司。
 
1.4  抗原
 
(1)本室按现行规程生产工艺制备的无色透明抗原,由10000ml病毒培养液制备的250ml抗原原液。
 
(2)本室按生产工艺改进法制备的无色透明抗原,由10000ml病毒培养液制备的250ml抗原原液。
 
(3)古巴抗原,此抗原用法国托马斯教授发放的马传贫免疫琼脂扩散试验国际标准阴阳性血清做过考核试验,被认为是世界上最好的4种马传贫琼扩抗原之一,由古巴合作方馈赠。

1.5  血清
 
(1)标准马传贫阳性血清,采自人工感染马传贫马,琼脂免疫扩散试验效价为1∶256,由本室保存。
 
(2)法国马传贫国际标准阴性血清10份,阳性血清20份,由法国托马斯教授馈赠。
 
(3)免疫马血清两匹接种8802批驴白细胞弱毒冻干疫苗免疫马(编号为H2和H8)接种后前2个月内每15天采血1次,以后每月采血1次直到接种后12个月,共采集28个样品,由本室保存。
 
(4)自然感染马血清和健康马血清:采自传贫病毒自然感染的病马,共23份血清,健康马血清20份,均由本室保存。

1.6  琼脂扩散试验方法以0.01molPBS(pH7.4)配制1%琼脂,在直径90mm的平皿内加入15~18ml琼脂,厚约2.5mm。以外径为5mm直径的薄壁金属管、孔间距为3mm组成的7孔梅花形打孔器打孔,按阳性参照血清与被检血清之比为3∶3的术式进行试验。置15~30℃条件下进行反应,逐日观察3天并记录结果。当阳性参照血清与抗原孔只有一条明显致密的沉淀线时,被检血清孔与抗原孔之间形成一条沉淀线,或者阳性参照血清的沉淀线末端向毗邻的被检血清的抗原方向偏弯者,则判定此被检血清为阳性,否则判阴性。
 
1.7  抗原标定将按现行规程生产工艺制备的抗原和按生产工艺改进法制备的抗原以0.01molPBS(pH7.4)分别做原液、1∶2~1∶32系列稀释,将标准阳性血清以0.01M PBS(pH7.4)分别做原液、1∶2~1∶256系列稀释,进行琼脂扩散方阵滴定试验,凡能与原液到1∶256倍稀释的阳性血清全部呈阳性反应的抗原为合格抗原。
 
1.8  法国马传贫国际标准阴、阳性血清对双扩散标定合格抗原的考核试验将经标准阳性血清标定的本室生产的两种合格抗原与法国托马斯教授馈赠的标准阴、阳性血清进行琼脂双扩散试验,同时以古巴抗原做对照。
 
1.9  免疫马血清的琼扩试验将经标准阳性血清标定的本室生产的两种合格抗原与本室保存的一匹经驴白细胞弱毒冻干疫苗免疫马血清进行琼脂双扩散试验,同时以古巴抗原做对照。1.10 自然感染马血清和健康马血清的琼扩试验将经标准阳性血清标定的本室生产的两种合格抗原与本室保存的自然感染马血清和健康马血清进行琼脂双扩散试验,同时以古巴抗原做对照。
 
2   结果

2.1  抗原标定
 
将按现行规程生产工艺制备的抗原和按生产工艺改进法制备的抗原与标准阳性血清进行琼脂双扩散方阵滴定试验。结果发现将按现行规程生产工艺制备的抗原只有1∶2稀释时能与标准阳性血清的原液到1∶256倍稀释时呈阳性反应,说明此抗原只有1∶2稀释时为合格抗原,见表1。而按生产工艺改进法制备的抗原1∶8稀释时为合格抗原,见表2。
 
 
表1   按现行规程生产工艺制备的抗原与标准(略)

表2   按生产工艺改进法制备的抗原与标准(略)
 
2.2   法国马传贫国际标准阴、阳性血清对琼脂双扩散标定合格抗原的考核试验将本室生产的两种合格抗原与法国托马斯教授馈赠的标准阴、阳性血清进行琼脂双扩散试验,同时与古巴抗原进行对照。发现此两种抗原与古巴抗原的检测结果完全一致,进一步验证了本室生产的抗原是合格的,见表3。
 
表3  本室生产的两种抗原及古巴抗原与法国马传贫(略)
 
2.3  与免疫马血清的琼扩试验
 
将经标准阳性血清标定的本室生产的两种合格抗原与本室保存的两匹经驴白细胞弱毒冻干疫苗免疫马血清进行琼脂双扩散试验,同时与古巴抗原进行对照。本室生产的两种合格抗原检测H2,其血清从第1个月到第4个月为阳性,其他均为阴性,而H8则从第1个月到第9个月为阳性。与古巴抗原检测结果完全一致,见表4。
 
2.4 与自然感染马血清和健康马血清的琼扩试验

   将经标准阳性血清标定的本室生产的两种合格抗原与本室保存的自然感染马血清(23份)和健康马血清(20份)进行琼脂双扩散试验,同时与古巴抗原进行对照。发现本室生产的两种抗原与古巴抗原检测结果一致,符合率为100%,见表5。
 
3  讨论

   马传染性贫血病是马属动物的一种重要的传染病,该病主要通过吸血昆虫进行传播。马传贫病毒是一个研究人免疫缺陷病毒很有价值的模式病毒,特别是我国自行研制的马传贫弱毒活疫苗为艾滋病疫苗的研制带来了新的希望。在美国有成千上万只马传贫阳性马,主要分布在墨西哥海湾和密西西比河流域的热带地区。目前,国际上通用的马传贫诊断方法仍然是琼脂免疫扩散试验,琼扩试验是马匹出口、运输和交易等活动中作为判定非马传贫感染马的基本方法。AGID操作简单,24~48 h可得出结果,对马传贫的控制起了很大的推动作用,在美国诊断为EIA的数量从1972年的82777匹到1991年的993712匹,阳性百分比从4.0%降低到0.82%。EIAV主要有3个结构蛋白能引起较强的免疫应答,产生较高滴度的抗体,这3个结构蛋白分别是表面蛋白(gp90)、跨膜蛋白(gp45)和核心蛋白(P26)。用Western Blot和ELISA检测EIAV接种马体液免疫应答动态时发现,在接种后10~14天可检测出抗p26抗体。我们生产的琼扩抗原主要是检测p26所诱导的抗体。
 
目前我国正在实施马传贫的扑灭计划,需要对马匹进行全面普查以筛选出马传贫阳性马再加以扑杀,这就需要大量的马传贫琼脂扩散试验的诊断抗原。本试验对琼扩抗原生产工艺进行了改进,使抗原原液的滴度由原来的1∶2提高到1∶8,使合格抗原产量提高了3倍,即每100ml病毒培养液由原来只能生产5 ml合格抗原提高到现在能生产20ml的合格抗原。这可能是因为0.5%的乳汉液和MEM培养基各50%的混合培养液更适合二倍体细胞的生产,从而更适合病毒的增殖,提高病毒滴度。而机械正压鼓风除醚法大大缩短了抗原暴露于常温的时间,从而减少了抗原滴度降低的机会。改进后生产的抗原仍然为无色透明,通过与法国马传贫国际标准阴、阳性血清进行的琼脂双扩散考核试验证实符合国际标准。本试验成功地改进了马传贫琼扩抗原生产工艺,大大地提高了抗原生产率,降低了生产成本,满足现地应用,为我国马传贫扑灭计划奠定了物质基础。
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