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基因工程技术在黄曲霉毒素生物降解中的应用

2017/9/27 9:44:00  来源:  中国农业科学  网友评论()
    黄曲霉毒素是一类主要由曲霉属的真菌,如黄曲霉、寄生曲霉产生的有毒次级代谢产物,具有强 的毒性、致癌性和诱变性。黄曲霉毒素影响动物生产性能,降低饲料转化效率,减少产肉量、产蛋量和 产奶量,增加动物发病率和死亡率,给畜牧业造成巨大的经济损失。早在1960年,英国仅在数个月内,相继死了10多万只火鸡,造成巨大经济损失,事后 推断是由于动物食用了霉变的巴西花生粕,而其 中就含有足以致鸡只死亡剂量的黄曲霉毒素。该毒素每年对亚洲养猪业造成的经济损失可能高达 11 亿。黄曲霉毒素广泛存在于食品和饲料原料中, 如花生、玉米、DDGS、青贮、油籽、牛奶、奶酪 和果汁中等。BINDER 等对在世界范围内收集到的2798份饲料及饲料原料样品测定霉菌毒素含量,结果发现亚洲和太平洋地区饲料及原料受黄曲霉毒 素污染严重,超标率高达 30.0%。RODRIGUES和 NAEHRER于2009—2011年检测了世界范围内共7049份饲料和饲料原料,其中黄曲霉毒素阳性样品检出率为33%,阳性样品中黄曲霉毒素平均含量为63 μg?kg-1,其最高含量为6105μg?kg-1。刘凤芝等对中国地区饲料原料和饲料中黄曲霉毒素污染情况 的调查结果显示,黄曲霉毒素污染主要存在于玉米、玉米副产物和蛋白原料中,检出率分别为95.13%、84.50%和86.11%。因此,寻求一种能够有效地控制和减少粮食以及饲料中黄曲霉毒素的方法成为当务之急。
    目前,饲料中黄曲霉毒素的脱毒方法主要采用物理吸附,但物理吸附仅是吸附了黄曲霉毒素,并不能减少毒素的量, 且效果不稳定, 可能会吸附饲料中的维生素等营养物质,造成饲料品 质下降。当前,利用微生物降解黄曲霉毒素由于具 有安全环保、解毒彻底、特异性强等优点而备受研究者的关注。近年来人们发现许多微生物,如枯草芽孢杆菌、黑曲霉、 糙皮侧耳以及红串红球菌等具有降解AF的作用。然而,通过微生物的筛选,虽然可以得到降 解黄曲霉毒素的特效菌株,但是往往其降解毒素的能 力不强。基因工程技术可以将活性高的解毒酶基 因进行克隆并在原核或真核工程菌中实现高效表达。 因此,利用基因工程技术,是未来生物降解黄曲霉毒 素的发展趋势。
    一、 基因工程技术在黄曲霉毒素生物降解中的研究进展
    基因工程技术在黄曲霉毒素生物降解中的运 用,可采用现代分子生物学的方法,从复合解毒酶 中分离纯化出特定的蛋白。但因微生物降解酶分离 纯化过程复杂、酶活不稳定、酶作用条件苛刻,较 难用于实际生产[18]。因此,人们利用基因工程手段 将活性高的解毒酶基因进行基因克隆,实现降解酶 基因在原核或真核工程菌种的异源高效表达,为研 究酶制剂在降解霉菌毒素实际生产中的作用奠定了理论基础。
    1、酶蛋白的分离纯化
    蛋白质是一种广泛存在的生物大分子物质,由氨基酸通过肽键组成多肽链后,经过盘曲折叠形成的具 有特定立体结构的、有活性的物质。蛋白质离开其 天然环境后极不稳定,每种蛋白质的提取纯化都需 要有特定的条件。若不能满足条件,蛋白质便不能 表现出其生物活性。因此在蛋白质的特性研究中,确定特定的提取和纯化方法具有重要的意义。酶 的分离纯化主要包括2个步骤:抽提和纯化。在分 离纯化过程中都必须检测酶的活性,以确定酶的纯 化程度和回收率。酶的分离方法主要有:硫酸铵沉淀法、有机溶剂提取法(甲醇、乙醇和异丙酮等)、聚合物絮凝剂沉淀法、金属离子和络合物沉淀法等。一般采用的是前两种方法。酶的纯化方法主要有:超滤、透析、亲和层析、凝胶层析、离子交换层析 和高效液相色谱法等。为了达到良好的分离纯化效果,通常几种方法结合使用。
    近年来,国内外研究学者报道了微生物能够产 生降解黄曲霉毒素的酶。从微生物分泌的复合酶中分离纯化出具有特定降解活性的未知蛋白,需要对这株菌的生理特性和代谢产物的产生规律有一定的研究,因此必须针对特定的微生物研究特定酶的制备和蛋白纯化方法。目前已知的对黄曲霉毒素具有 降解活性的真菌酶主要有漆酶和氧化酶。例如:MOTOMURA等采用硫酸铵沉淀、透析DEAE琼脂糖凝胶和苯基琼脂糖凝胶层析,从食用菌糙皮侧耳 (Pleurotus ostreatus,又称平菇)的发酵上清液中分离纯化出分子量为 90 kD 的胞外酶,鉴定为漆酶。 该酶在 pH 4—5、温度 25℃时,降解黄曲霉毒素B1(AFB1)的活性最高,荧光光谱和 TLC 检测结果表 明此酶可以断裂降解黄曲霉毒素B1的内酯环。YEHIA用硫酸铵沉淀后,采用 DEAE 琼脂糖凝胶层 析和 Sephadex G-100 分子筛从糙皮侧耳中分离纯化出分子量约为 42 kD 的锰过氧化物酶(Manganese peroxidase,MnP),酶活为 81 U?mL-1,比活78 U?mg-1,该酶(1.5 U?mL-1)与 AFB1反应 48 h 后,其对 AFB1 降解率达到 90%。此外,白腐真菌污色原毛平革菌 (Phanerochaete sordida)也分泌能有效降解黄曲霉毒 素 B1 的 MnP 酶,其原理是 MnP 首先将黄曲霉毒素 B1 转化成黄曲霉毒素 B1-8,9-环氧化合物,然后黄曲 霉毒素 B1-8,9-环氧化合物再水解成为黄曲霉毒素 B1-8,9-二氢二醇。真菌分泌的酶中除了漆酶和氧 化酶外,刘大岭课题组采用硫酸铵沉淀法和液相色 谱层析法从假蜜环菌(Armillariella tabescens)菌丝 球中分离纯化出一种全新的黄曲霉毒素解毒酶,该 酶分子质量约为 51.8 kD,在 pH 6.8 和温度 35℃时 酶活最大。通过进一步研究证明 ADTZ 是一种 黄曲霉毒素氧化酶(AFO),高效薄层色谱检测表明,该酶可将黄曲霉毒素 B1 分子结构中的双呋喃环断裂,并且该降解过程为氧气依赖型,可同时产生过氧化氢且过氧化氢在AFO的脱毒过程中起着 重要作用。
    除了真菌可分泌降解黄曲霉毒素的漆酶和氧化酶 外,研究者对细菌分泌的酶对黄曲霉毒素降解作用也 作了一些研究。放线菌目中能够降解黄曲霉毒素的菌种较多,这可能是因为 FDR-A 酶系广泛存在于放 线菌目微生物中。FDR-A 酶系是耻垢分支杆菌(Mycobacterium smegmatis)产生的脱氮黄素辅助因 子 F420H2依赖的还原酶系,能够催化黄曲霉毒素分子 中 α,β-不饱和酯的还原,激活毒素自发水解生成一种 新的降解产物。除了放线菌外,李超波等从金毛 羚牛粪便中筛选出施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)F4,其降解毒素活性物质主要存在于菌体细 胞中,菌体细胞作用72h后毒素降解率达到 82.91%。通过进一步研究,杨文华等对F4的产酶条件进行 优化,然后通过 55%硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝 胶过滤层析分离纯化出黄曲霉毒素B1降解酶。HPLC 对降解产物分析表明,F4将黄曲霉毒素 B1 降解为至 少 2 种产物,并用 Q-TOF 一级和二级飞行质谱测定分 析,得到产物可能的结构式,从而明确了黄曲霉毒素 B1的降解途径。GUAN 等从豚鹿粪中初步筛选出 一株高效降解黄曲霉毒素的橙红色粘球菌 (Myxococcus fulvus)。ZHAO 等对该菌株进行研 究后发现该菌的降解活性物质是一种胞外酶,依次采 用乙醇沉淀、阴离子交换层析和分子筛层析后分离纯 化出黄曲霉毒素 B1 降解酶的纯酶,其分子量约为32kD,酶活为569.44×103 U?mg-1,100 U?mL-1纯酶48h可高效降解黄曲霉毒素 B1 (85.1%)、G1 (96.96%) 以及 M1 (95.80%),酶反应最适 pH 范围在 5.0—7.0 间,最适反应温度为 30—45℃。采用液质联用和红外 光谱法分析产物的分子结构,推测该酶降解黄曲霉毒 素 B1 的过程是使香豆素环的芳香内酯和甲氧基发生 了改变。
    2、酶基因的克隆及表达
    基因工程技术是蛋白质工程的基础,基因重组技 术使从基因水平上改造微生物蛋白质成为可能。基因 工程技术包括许多步骤,第一步就是目的基因的克隆。一般来说,基因克隆是指将来自不同生物的目的基因 从生物体基因组中分离,并与载体 DNA 连接构成新 的重组 DNA,然后在受体细胞内进行复制、扩增(也 包括目的基因的无细胞扩增 PCR)的技术。cDNA 末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)是在 PCR 基础上逐步成熟的一项技术,以其 敏感性高、简单、快速和廉价等优势而广泛应用于未 知基因全长 cDNA 的获得。RACE 通过 PCR 由已知的 cDNA 部分序列分别设计特异性引物,来获得其完整 的 5′和 3′末端序列,这样的两个反应分别被称作 5′-RACE 和 3′-RACE。
    基因工程的核心内容是使目的基因在异源宿主 中大量表达产生重组目的蛋白。目的基因的表达主 要涉及三个要素:用于表达的合适的 DNA 序列(目的基因)、基因表达载体系统和表达宿主(受体细 胞或受体菌)。原核基因外源表达是将目的基因片 段连接至合适的原核表达载体后,转化进入原核菌 体,随后通过温度、诱导剂和诱导时间的控制,诱导其在宿主菌内进行目标蛋白质的重组表达。原核细胞是目前最为常用的表达宿主,已广泛用于各种来源(原核生物、真核生物和病毒等)的目的基因表达。常见的原核表达系统有:大肠杆菌表达系 统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统和蓝藻表达系统等。其中,大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早,目前应用最广泛的经典表达系统。 与其他表达系统相比,大肠杆菌表达系统具有遗传 背景清除、培养方法简单、培养周期短、抗污染能力强、目的基因表达水平高等特点。因此,它在基因表达技术中占有重要的地位,是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。虽然大肠杆菌表达系统具有周期短、表达产量高、操作简 单等优点,但其不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白加工修饰能力,难以表达结构复杂的蛋白质,其产物往往形成包涵体。毕赤酵母表达系统采 用了醇氧化酶(alcohol oxidiase,AOX1)的强启动子,在无其他碳源存在的条件下,能以甲醇为唯一 碳源,并且受甲醇唯一调控。毕赤酵母自身的分泌 性蛋白很少,利用酵母的 α-信号肽能将外源蛋白质 分泌到细胞外,这些都有利于重组蛋白的下游纯化工作。与大肠杆菌相比,酵母是单细胞真核生物,它既具有原核生物易于培养、繁殖快、成本低、便于基因工程操作等特点,又有比较完备的基因表达 调控机制和对表达产物进行加工及翻译后修饰的功能。因此,以酵母为宿主建立的基因表达系统日益 受到重视并被广泛应用。
    关于重组酶生物降解黄曲霉毒素的研究非常少。 ALBERTS 通过基因克隆,将外源白腐真菌(T. versicolor)的漆酶基因导入黑曲霉中进行重组表达, 表达的重组漆酶(118 U/L)对 AFB1的降解率为 55%。 对细菌降解酶基因克隆仅见有假蜜环菌黄曲霉毒素降 解酶的报道,试验中根据质谱分析得到的N末端氨基 酸序列设计引物,以假蜜环菌总 RNA 为模板进行 RT-PCR 和 Smart RACE,得到黄曲霉毒素降解酶基因的序列长约为 2.3 kb,进一步分析序列含有完整的开 放阅读框,3′端和 5′端的非翻译区,编码黄曲霉毒素 降解酶成熟肽的全长 cDNA 含有 2 088 个核苷酸碱基,编码695 个氨基酸,经 SDS-PAGE 电泳后发现其分子量约为 73—77kD。然后,将包含上述基 因的表达载体转化到真核及原核宿主细胞得到新的黄曲霉毒素降解酶的重组酶。在原核表达系统中的 运用,首先构建与 pMAL-e2x 的重组质粒,转化至 大肠杆菌 Rosetta 中进行诱导表达,表达的 rADTZ 蛋白可降解黄曲霉毒素 B1,酶比活为 136 U?mg-1,同 时用圆二色光谱对酶蛋白的二级结构进行了分析。在真核表达系统中,将编码黄曲霉毒素降解酶成熟 肽的基因从假蜜环菌的 cDNA 中扩增出来,克隆到 真核整合型分泌表达载体 pHIL-S1 上,将重组表达 载体转化进入毕赤酵母 GS115 中,此表达载体以 AOX 为启动子。重组蛋白的表达量占培养基总蛋白的25%以上,且可溶。
    二、基因工程技术在霉菌毒素降解中的前景展望
    从现有霉菌毒素生物降解的研究成果看出,虽然 现在越来越多的研究者发现一些真菌和细菌都具有降 解毒素的作用,但一些真菌与动物真菌性疾病有关, 不适合用于实际生产;食用真菌虽有较好的解毒效果, 但起作用的真菌酶多源于胞内,产量极低,操作过程 需要破碎真菌细胞或菌丝体,程序繁琐,容易破坏酶 的活性,不易进行提取、纯化,限制了对酶学性质的 深入研究;已经发现的部分细菌如枯草芽孢杆菌除 降解霉菌毒素外,自身兼有益生性、抗逆性等,易于分离纯化,较适于实际生产的应用。然而这些细菌酶 产量不高,酶促反应条件苛刻,因此,寻找和筛选能 降解霉菌毒素的细菌,对其所产胞外降解酶进行特性 研究后对降解酶基因进行克隆和表达是霉菌毒素生物 降解研究领域的发展方向。
    国内外关于基因工程技术在霉菌毒素降解中的运 用报道不多。目前,人们已经发现了一些专用的酶可 以破坏霉菌毒素分子的功能基团,将霉菌毒素毒性降 低或转化为无毒产物。例如:酯酶可以破坏玉米赤霉 烯酮的内酯环,使玉米赤霉烯酮无法与雌激素受体竞 争性结合,而成为无害的代谢物排出体外。氯酶可以脱解单端孢霉烯类毒素分子中的环氯基团。环氧基酶可以切断所有镰孢菌属毒素如 T-2 毒素、HT-2 毒 素、呕吐毒素(DON)及草镰孢烯醇毒素(DAS)中 12、13 位碳原子上的环氧化物,使其毒性消失。因微生物降解酶分离纯化过程复杂、酶活不稳定、酶作 用条件苛刻,较难用于实际生产,故基因克隆及表达 技术在解毒中的运用显得越来越重要。然而降解酶基 因序列的寻找有一定的复杂性和多变性,因此,能否 准确获得降解酶基因全长序列,直接影响该酶体外表 达的酶活。随着生物技术和基因工程技术的发展,一定能分离纯化出高活性的降解酶基因,并将其转化到 表达系中进行高效表达。最终实现在同一个表达系统 中表达一种或多种降解酶,从而生产出新型、高效、 安全的霉菌毒素降解酶。
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